城市生活污水抗生素抗性基因污染研究

　　隨著(zhù)我國新型城鎮化的不斷推進(jìn)以及城市人口的持續增加，城市生活污水和生活垃圾的產(chǎn)生量也不斷增加.城市生活污水和生活垃圾填埋場(chǎng)產(chǎn)生的垃圾滲濾液是城市環(huán)境保護工作的重點(diǎn)和難點(diǎn).抗生素在養殖、醫療保健等行業(yè)被廣泛使用，并存在著(zhù)過(guò)度使用、長(cháng)期濫用等現象，并且產(chǎn)生了嚴重的環(huán)境抗生素抗性的問(wèn)題，抗生素抗性基因在環(huán)境中不斷傳播與富集，嚴重危害人類(lèi)健康與環(huán)境安全.各種環(huán)境介質(zhì)中，包括豬場(chǎng)土壤[1, 2]、污泥堆肥[3, 4]、城市河流水體[5]、施用豬糞水稻土[6]，甚至自來(lái)水[7, 8]中也檢測出環(huán)境抗生素抗性基因，環(huán)境抗生素抗性基因研究取得了一些進(jìn)展[9]. Pruden等[10]2006年首次提出將抗生素抗性基因作為一種新型環(huán)境污染物，逐漸引起全球科學(xué)家和公眾的高度關(guān)注.

　　城市生活污水主要是指城市生活中的各種餐廚污水、垃圾、糞便、洗滌劑等各種污染水體形成的混合污水，氮、磷、硫等營(yíng)養元素含量較高，微生物含量高，并且含有病原微生物[11, 12].生活垃圾填埋場(chǎng)是城市生活垃圾、污水廠(chǎng)的處置污泥、電子廢棄物、垃圾焚燒廠(chǎng)飛灰殘渣等固體廢棄物的主要最終堆放場(chǎng)所.垃圾滲濾液是伴隨垃圾填埋場(chǎng)運營(yíng)整個(gè)生命周期的“二次污染物”.生活垃圾滲濾液具有污染物成分復雜，污染物濃度高的特點(diǎn)，相較于城市生活污水，其高濃度的氨氮、有毒有害物質(zhì)，重金屬離子等特征形成了一個(gè)特殊環(huán)境，尤其是場(chǎng)齡大于5 a的垃圾滲濾液可生化性差[13].受人類(lèi)生產(chǎn)生活的影響，城市生活污水和垃圾滲濾液中含有抗生素殘留以及抗生素抗性的微生物，被認為是環(huán)境抗生素抗性的一個(gè)重要存儲庫[14~16].

　　由于垃圾滲濾深度處理后產(chǎn)生了難以處理的濃縮液，垃圾滲濾液(包括濃縮液)往往被運送到城市生活污水處理廠(chǎng)進(jìn)行合并處理[13, 17].目前，城市生活污水處理過(guò)程中的抗生素抗性基因污染分布及演變有較多相關(guān)研究[18, 19]，并且主要是針對磺胺類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)等少數幾種抗生素抗性基因.針對城市生活污水(接收垃圾滲濾液進(jìn)行合并處理)和生活垃圾滲濾液環(huán)境抗生素抗性的對比研究，從抗生素抗性譜的角度全面研究這兩者間的抗性基因污染還沒(méi)有或者比較少相關(guān)研究報道.因此，對城市生活污水和生活垃圾滲濾液中抗生素抗性種類(lèi)、分布格局開(kāi)展對比研究，比較兩者之間的異同，綜合分析研究城市生活污水和垃圾滲濾液抗生素抗性基因污染狀況，對于加強城市生活污水和垃圾滲濾液管理與處置，評估兩者的生態(tài)安全情勢和環(huán)境風(fēng)險顯得十分必要.

　　1 材料與方法

　　1.1 樣品采集及前處理

　　城市生活污水樣品于2015年7月采集自廈門(mén)市某污水處理廠(chǎng)(接收廈門(mén)市東部固廢處理中心生活垃圾填埋場(chǎng)部分的垃圾滲濾液和垃圾滲濾液處置后濃縮液)的進(jìn)水樣品1 L(3個(gè)采樣平行樣品)，其中添加了終濃度為50%乙醇進(jìn)行預處理，用于固定污水中微生物.生活垃圾滲濾液采樣地點(diǎn)位于廈門(mén)市東部固廢處理中心生活垃圾填埋場(chǎng)，于2015年7月采集了垃圾滲濾液調節池末端，也是滲濾液處理站污水進(jìn)口端樣品1 L(3個(gè)采樣平行樣品)，同樣在采集樣品中添加了乙醇進(jìn)行預處理.所采集的城市生活污水和生活垃圾滲濾液，存放在低溫采樣箱中并迅速轉移至實(shí)驗室的-20℃冰箱中保存，用于環(huán)境樣品的DNA提取.

　　1.2 城市生活污水和生活垃圾滲濾液DNA提取

　　量取城市生活污水(raw wastewater，RWW)和生活垃圾滲濾液(raw leachate，RLC)各40 mL，分裝到50 mL離心管中，使用12 000 r ·min-1轉速離心10 min，倒掉上清液，每個(gè)離心管中再加入1 mL生理鹽水，振蕩并懸浮起離心管底部固體，從而達到清洗效果.再將離心管中的全部樣品分別轉移至新的1.5 mL離心管中，18 000 r ·min-1轉速離心后，棄去上清液.然后加入FastDNA® Spin Kit for Soil試劑盒(MP Biomedicals，美國)中的PBS緩沖液(978 μL).

　　隨后將上述含有采集樣品的PBS緩沖液轉移至試劑盒中的Lysing Matrix E tube，按照生產(chǎn)商提供的方法提取樣品中的總DNA，然后用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳驗證.樣品所提取的DNA樣品用QuantiFluor® dsDNA System(Promega Corporation，美國)試劑盒測定雙鏈DNA濃度.根據測定的樣品DNA濃度，實(shí)驗樣品用滅菌的超純水統一稀釋至50 ng ·μL-1.

　　1.3 高通量熒光定量PCR

　　采用SmartChip Real-Time PCR Systems(WaferGen Inc.，美國)高通量熒光定量反應平臺.研究中所采用的293對引物在先前的相關(guān)的研究中被有效驗證過(guò)[1].此外另外添加了1對用于檢定超級細菌抗生素抗性基因blaNDM-1的引物[20]，1對intI 1 整合子基因(class1 integron)引物[21]和1對CintI 1臨床醫學(xué)意義上的整合子基因(clinical class 1 integon)引物[22].

　　PCR擴增反應的體積為100 nL.反應體系中各試劑的終濃度為： 1×的LightCycler 480 SYBR® Green ⅠMaster Mix(Roche，美國), nuclease-free PCR-grade water，1 ng ·μL-1的BSA，5 ng ·μL-1的DNA模板，1 μmol ·L-1的上下游引物. PCR反應條件為： 95℃預變性10 min;95℃變性30 s，60℃退火延伸30 s，總共40個(gè)循環(huán);儀器程序自動(dòng)升溫進(jìn)行熔解曲線(xiàn)分析.高通量定量PCR每個(gè)芯片都有不添加DNA模板的陰性對照. qPCR反應得到的數據通過(guò)Cycler預設定的篩選條件(擴增效率介于1.8~2.2)進(jìn)行導出.根據SmartChip Real-Time PCR Systems的靈敏度和精確度，確定循環(huán)次數CT值為31時(shí)作為儀器的檢測限.每個(gè)樣品都進(jìn)行3次技術(shù)重復實(shí)驗，當3次技術(shù)重復都被擴增出來(lái)時(shí)認為是陽(yáng)性擴增，3個(gè)采樣平行樣品都是陽(yáng)性擴增時(shí)，認為樣品的目的基因被有效檢出.

　　1.4 數據分析

　　基因的相對拷貝數(gene relative copy number)參照Looft等[23]的研究，用公式(1)進(jìn)行估算.根據Schmittgen等[24]關(guān)于相對定量分析方法，用FC(fold change)值，采用公式(2)來(lái)計算表征相對于城市生活污水對照樣品，生活垃圾滲濾液的抗生素抗性的富集或者衰減狀況.

　　(1)

　　(2)

　　式中，CT是PCR反應收集到特定熒光時(shí)的循環(huán)次數，ARG代表抗生素抗性基因，16S是代表 16SrDNA基因，Target是環(huán)境實(shí)驗樣品，Ref是對照樣品，FC是ARGs拷貝數的富集或衰減程度.當FC=2[-(ΔΔCT+2 s)]>1時(shí)，且student t檢驗具有顯著(zhù)性時(shí)，認為環(huán)境實(shí)驗樣品相對于對照樣品顯著(zhù)富集.

　　2 結果與討論 2.1 城市生活污水和垃圾滲濾液中抗生素抗性基因的多樣性

　　根據實(shí)驗中使用的296對引物，按照基因對應抗生素類(lèi)型分為氨基糖苷類(lèi)抗生素(Aminoglycoside)、 β-內酰胺類(lèi)抗生素(β-Lactamase)、氯霉素類(lèi)抗生素(Chloramphenicol)、大環(huán)內脂類(lèi)-林肯酰胺類(lèi)-鏈陽(yáng)性菌素B類(lèi)抗生素(MLSB)、磺胺類(lèi)抗生素(Sulfonamide)、四環(huán)素類(lèi)抗生素(Tetracycline)、萬(wàn)古霉素類(lèi)抗生素(Vancomycin)和其他類(lèi)或者發(fā)揮外排泵作用(other/efflux)這8類(lèi)抗生素抗性基因.城市生活污水(RWW)檢測出187抗生素抗性基因，垃圾滲濾液檢測出39中抗生素抗性基因(圖 1).其中，城市生活污水檢測到的抗生素抗性基因涵蓋了以上全部8類(lèi)抗生素類(lèi)型，而垃圾滲濾液檢測到的抗性基因類(lèi)型只含有氨基糖苷類(lèi)抗生素(Aminoglycoside)、大環(huán)內脂類(lèi)-林肯酰胺類(lèi)-鏈陽(yáng)性菌素B類(lèi)抗生素(MLSB)、四環(huán)素類(lèi)抗生素(Tetracycline)和其它類(lèi)或者發(fā)揮外排泵作用(other/efflux)這4類(lèi)抗生素抗性類(lèi)型.有研究表明，垃圾滲濾液中四環(huán)素類(lèi)抗生素類(lèi)型在中國6個(gè)不同地理位置的垃圾填埋場(chǎng)滲濾液中被有效檢出[25, 26]，與本研究結果一致.此外，垃圾滲濾液檢測到的4類(lèi)抗生素抗性類(lèi)型中的抗性基因數目均小于生活污水中的對應類(lèi)型抗性基因數目.抗生素抗性基因按照抗性機制可以分成抗生素失活(deactivation)、外排泵作用機制(efflux)、核糖體保護機制(protection)和未知抗性機制(unkown)四大類(lèi).將檢測到的抗生素抗性基因從抗生素抗性機制歸類(lèi)分析，抗生素失活(deactivation)是兩種污水微生物抗生素抗性最主要機制，比例分別為48.13%和51.28%(圖 2).垃圾滲濾液檢測到的39種抗生素抗性基因中只有erm(35)基因僅在垃圾滲濾液中檢出，其余38種抗性基因在城市生活污水同時(shí)被有效檢出.總體結果表明，城市生活污水和垃圾滲濾液檢測到的抗生素抗性種類(lèi)有顯著(zhù)差異(P < 0.05).

　　圖 1 檢測到的抗生素抗性基因種類(lèi)數

　　圖 2 抗生素抗性機制的相對比例

　　2.2 抗生素抗性基因在城市生活污水和垃圾滲濾液中的污染分布格局

　　主成分分析表明，城市生活污水和垃圾滲濾液抗生素抗性基因結構不同，PCA1解釋了抗性基因結構變化的98.8%，城市生活污水和垃圾滲濾液抗性基因沿第一軸分為兩個(gè)簇，表明抗生素抗性基因在兩種城市污水有著(zhù)不同的分布格局(圖 3).城市生活污水抗生素抗性基因分布相較于垃圾滲濾液更具有一致性.

　　圖 3 城市生活污水和垃圾滲濾液抗生素抗性基因多樣性主成分分析

　　Auerbach等[27]的研究表明，城市生活污水(污水處理廠(chǎng)進(jìn)水)四環(huán)素類(lèi)抗生素抗性基因的豐度高達109 copies ·L-1數量級.相較于垃圾滲濾液，熱圖分析表明(圖 4)，城市生活污水的抗生素抗性基因豐度和多樣性均顯著(zhù)大于垃圾滲濾液(P < 0.05). 圖 4中A簇代表抗生素抗性基因在城市生活污水和垃圾滲濾液中均有檢出，主要類(lèi)型是氨基糖苷類(lèi)和四環(huán)素類(lèi)抗生素抗性基因，并且A1簇的抗生素抗性相對于A(yíng)2簇顯著(zhù)富集. B簇和C簇中的抗生素抗性基因僅在城市污水中檢出，垃圾滲濾液中未檢出(D簇)，并且抗生素抗性潛在表達強度B簇大于C簇.垃圾滲濾液是垃圾填埋體產(chǎn)生的“二次污染物”[28]，運營(yíng)時(shí)間5 a以上的垃圾填埋場(chǎng)產(chǎn)生的垃圾滲濾液含有多種有毒有害物質(zhì)，并且氨氮濃度高，可生化性差[13]，高通量定量PCR結果表明垃圾滲濾液抗生素抗性類(lèi)型和抗性基因豐度低于城市生活污水，熱圖分析總體結果顯示，城市生活污水和生活垃圾滲濾液抗性基因污染分布格局顯著(zhù)不同.

　　圖 4 城市生活污水和垃圾滲濾液抗生素抗性基因污染分布格局

　　2.3 抗生素抗性基因豐度與城市生活污水抗性基因的富集

　　廣州、福州等地的污水廠(chǎng)接納當地生活垃圾填埋場(chǎng)垃圾滲濾液進(jìn)行合并處理，普通生活污水處理廠(chǎng)承擔部分垃圾滲濾液的處理任務(wù)已經(jīng)成為垃圾滲濾液處理的“新常態(tài)”，實(shí)踐證明是一種經(jīng)濟有效的方式[13, 17].本研究中采集的城市生活污水樣品中含有一定量的垃圾滲濾液(濃縮液)，因此可以將垃圾滲濾液作為對照樣品，研究抗生素抗性基因的在這兩種城市污水的異同.根據Schmittgen等[24]關(guān)于基因拷貝數(gene copy number)的計算(估算)方法，得到了抗生素抗性基因的基因拷貝數(圖 5).抗生素抗性基因在城市生活污水抗性基因拷貝數最高是others類(lèi)(包含多重耐藥基因、轉座子基因、整合子基因等)抗性基因，除此之外，氨基糖苷類(lèi)抗生素和四環(huán)素類(lèi)的抗性基因的基因拷貝數分別達到了1.4×108 copies ·L-1、 3.6×107 copies ·L-1.垃圾滲濾液中檢測到的39種抗性基因，分為4大類(lèi)，基因拷貝數最高的是氨基糖苷類(lèi)抗生素抗性基因，達到1.1×105 copies ·L-1，顯著(zhù)低于生活污水中的抗性基因豐度(P < 0.05).

　　圖 5 城市生活污水和垃圾滲濾液抗生素抗性基因豐度

　　城市生活污水氮磷等營(yíng)養元素豐富，相對于垃圾滲濾液其有毒有害物質(zhì)濃度較低，微生物數量多，世代更新快，并且微生物種類(lèi)繁多等特性，兩者合并處理有一定優(yōu)勢[13].城市生活污水檢出富集的抗性基因總共有7大類(lèi)，其中119種抗生素抗性基因和可移動(dòng)元件顯著(zhù)增加(P < 0.05)，富集倍數前三的基因是轉座子tnpA-04基因、 blaVEB和blaOXA10-01，分別達到了3 338、 1 061和1 001倍(圖 6)，表明轉座子基因和β-內酰胺類(lèi)抗生素抗性基因在城市生活污水中顯著(zhù)富集.環(huán)境抗生素抗性基因在微生物中存在著(zhù)水平基因轉移機制(horizontal gene transfer，HGT)，可移動(dòng)元件(MGEs)與總抗生素抗性存在線(xiàn)性相關(guān)[7]，可能是污水廠(chǎng)的進(jìn)水普遍有較高的檢出率和富集現象的原因之一.抗生素殘留和重金屬離子對抗生素抗性具有共選擇或者誘導作用，導致了特定類(lèi)型的抗生素抗性基因的出現和富集[10, 29].城市生活污水和垃圾滲濾液都是人類(lèi)生產(chǎn)生活末端的“副產(chǎn)物”，含有一定量的抗生素殘留和重金屬離子，在分子機制上進(jìn)一步研究它們與抗生素抗性基因的關(guān)系，分析抗性基因在環(huán)境物質(zhì)脅迫下的演變傳播顯得十分必要.

　　圖 6 城市生活污水富集的抗生素抗性基因

　　雖然Wang等[25]和Wu等[26]的研究表明垃圾滲濾液可以檢測出四環(huán)素類(lèi)和磺胺類(lèi)等少量幾種抗生素抗性基因，但是本研究的結果表明垃圾滲濾液抗性基因豐度并不高，垃圾滲濾液可以跟城市生活污水合并處理，但是還需考慮高濃度抗生素殘留和重金屬等可能促進(jìn)城市生活污水抗生素抗性的潛在影響.此外，城市生活污水中高豐度和多類(lèi)型的抗生素抗性基因對于人工濕地處理生活污水等處理方式可能潛在的生態(tài)環(huán)境安全風(fēng)險也提供了新的考量和評價(jià)視角.

　　3 結論

　　(1) 垃圾滲濾液抗生素抗性基因豐度不高，可以接入城市生活污水廠(chǎng)合并處理，城市生活污水是環(huán)境抗生素抗性的一個(gè)重要存儲庫.

　　(2) 抗生素抗性基因在城市生活污水和生活垃圾滲濾液中既有區別又有聯(lián)系，有著(zhù)顯著(zhù)不同的分布格局.(來(lái)源及作者：中國科學(xué)院城市環(huán)境研究所城市環(huán)境與健康重點(diǎn)實(shí)驗室 黃福義、李虎、安新麗、歐陽(yáng)緯瑩、蘇建強)