焦化廢水活性污泥中降解硫氰化物細菌研究

　焦化廢水是煤在高溫干餾過(guò)程中以及煤氣凈化、 化學(xué)產(chǎn)品精制過(guò)程中產(chǎn)生的高濃度、 難降解有機工業(yè)廢水，酚類(lèi)是其主要有機組分，其他的有機物包括多環(huán)芳烴和一些含有氮、 氧和硫的雜環(huán)化合物，無(wú)機組分則包括氰化物、 硫氰化物(SCN-)和氨氮等[1, 2]. 酚類(lèi)、 硫氰化物和氰化物是焦化廢水中COD 的3 大主要來(lái)源，SCN-在焦化廢水中的濃度為200~1000 mg·L-1，是僅次于酚類(lèi)的第2 大COD來(lái)源; 由于SCN-的毒性相對較低，其在焦化廢水處理過(guò)程中受到的重視程度遠不如揮發(fā)酚和氰化物等污染物[3, 4]. SCN-是苯酚和氨生物降解的抑制劑[5, 6]，對硝化過(guò)程有抑制作用[4]. 同時(shí)，SCN-的轉化需要大量的氧化劑或溶解氧，且可能生成CN-中間產(chǎn)物[7]，因此，SCN-不僅對焦化廢水的主要控制指標COD、 色度及NH4+-N等有直接或間接作用，還會(huì )使廢水毒性增高. 因此，焦化廢水中的SCN-必須徹底有效去除，以消除廢水對生態(tài)環(huán)境帶來(lái)的潛在威脅和危害.

　　焦化廢水的處理過(guò)程主要包括脫酚、 蒸氨、 脫氰、 除油、 生化處理、 混凝沉淀和后續高級氧化等. 其中生化處理是焦化廢水處理的主體和核心，如缺氧-好氧、 厭氧-缺氧-好氧和序批式活性污泥法等[8]. 污泥的細菌群落結構在廢水的生物處理過(guò)程中起著(zhù)至關(guān)重要的作用，決定廢水中污染物的去除效率[9, 10]. Zhu等[11]利用454高通量測序研究了焦化廢水厭氧/缺氧/沸石生物濾池-膜生物反應器中微生物的群落結構組成和動(dòng)態(tài)變化，結果表明沸石材料可以改變微生物菌群結構，促進(jìn)了一些新類(lèi)群的出現，使氨氧化菌和亞硝化細菌逐漸成為優(yōu)勢菌. 曹軍偉等[12]通過(guò) PCR 和 16S r DNA 序列分析技術(shù)，在焦化活性污泥中鑒定了20個(gè)屬的28種酚類(lèi)化合物降解菌. 喬琳等[13]通過(guò)末端限制性片段長(cháng)度多態(tài)性(T-RFLP) 分析手段，探討了固定化生物強化與對照反應器中微生物群落結構的動(dòng)態(tài)變化，表明在吡啶初始濃度為 782.4~2934 mg·L-1時(shí)，投加的菌株P(guān)aracoccus sp.KT-5可以作為優(yōu)勢菌始終存在于反應器中. Huddy等[14]利用基因克隆文庫分析表明Thiobacillus 是ASTERTM生物處理系統中SCN-降解的優(yōu)勢菌. Ryu等[15]利用高通量解析了SCN-降解過(guò)程中的藻類(lèi)和細菌群落結構的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現Thiobacillus 細菌和Micractinium 藻類(lèi)為優(yōu)勢生物. 焦化廢水處理系統功能的穩定性主要依靠?jì)?yōu)勢微生物的活性和多樣化的群落結構間的相互關(guān)系[16]，SCN-是焦化廢水中COD的主要來(lái)源之一，其好氧段生物去除效果影響廢水的達標排放，而降解SCN-的細菌群落結構依然處于“黑匣子狀態(tài)”. 對焦化廢水活性污泥中降解SCN-的微生物進(jìn)行分子生態(tài)學(xué)研究，有助于探討焦化廢水處理的工藝改進(jìn)、 動(dòng)態(tài)監控和優(yōu)化控制.

　　本研究利用KSCN為唯一碳源和能源，采用逐步提高其濃度的方法富集焦化廢水活性污泥中的SCN-降解菌群，并利用454測序分析其細菌多樣性以及在不同SCN-濃度條件下群落結構的演替變化，以期為焦化廢水處理工藝的穩定運行提供理論基礎.

　　1 材料與方法

　　1.1 主要試劑和材料

　　生工Ezup柱式土壤基因組DNA抽提試劑盒，KSCN(分析純); 接種污泥采集自鞍山某焦化廠(chǎng)好氧池.

　　1.2 污泥的馴化培養

　　取適量經(jīng)沉淀濃縮的新鮮活性污泥于有機玻璃反應器中，加入用自來(lái)水配置的濃度為100 mg·L-1的KSCN水溶液，使其污泥濃度為3~5 mg·L-1，在溫度為31℃條件下充分曝氣(DO 4.0~7.0 mg·L-1)，定時(shí)取樣檢測活性污泥降解SCN-的能力，同時(shí)設置未加污泥的污水做對照組. 活性污泥可以在24 h內可完全降解100 mg·L-1的SCN-，靜置1 h后去除上清液，加入新鮮的100 mg·L-1的KSCN水溶液在相同條件下繼續培養24 h(1號樣品)，去除上清液后加入濃度為300 mg·L-1的KSCN水溶液，培養2 d(一個(gè)周期)更換新的KSCN水溶液，8個(gè)周期后(2號樣品)加入濃度為600 mg·L-1 的KSCN水溶液繼續馴化培養，6個(gè)周期后結束培養(3號樣品).

　　1.3 活性污泥對SCN-濃度的生物降解

　　分別取適量經(jīng)沉淀濃縮的新鮮活性污泥和100~600 mg·L-1 KSCN馴化富集的活性污泥于有機玻璃反應器中，加入用自來(lái)水配置的濃度分別為100、 300、 600 mg·L-1的KSCN水溶液，使其污泥濃度為3~5 mg·L-1，在溫度為31℃條件下充分曝氣定時(shí)取樣，檢測活性污泥對SCN-的降解能力. SCN-的測定方法參照文獻[17].

　　1.4 細菌多樣性分析

　　1.4.1 污泥樣品預處理

　　將不同周期培養后的活性污泥樣品置于1、 2和3離心管中離心棄上清，用已滅菌的生理鹽水洗滌 2~3次，用于后續污泥細菌總DNA的提取、 PCR和測序分析.

　　1.4.2 污泥細菌總DNA 提取、 PCR和16S rDNA測序

　　污泥細菌總DNA 提取、 PCR和16S rDNA測序由上海生工公司完成. 細菌總DNA 提取按照生工Ezup柱式土壤基因組DNA抽提試劑盒進(jìn)行. PCR擴增引物： 341F CCTACGGGNGGCWGCAG 和805R GACTACHVGGGTATCTAATCC[18]，擴增區域V3-V4. 反應條件94℃ 30 s; 94℃ 20 s，45℃ 20 s，65℃ 60 s，5個(gè)循環(huán); 94℃ 20 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，20個(gè)循環(huán); 72℃ 5 min，10℃. 50 μL反應體系，50 μL PCR反應體系及10×PCR buffer 5 μL，dNTP (10 mmol·L-1) 0.5 μL，Genomic DNA10 ng，引物F(50 μmol·L-1) 1 μL，引物R (50 μmol·L-1) 1 μL，Plantium Taq (5 U·μL-1) 0.5 μL，水42 μL. 各樣品PCR 擴增后，利用Roche 454 GSFLX+測序儀上機測序.

　　1.4.3 序列數據處理

　　原始序列數據通過(guò)質(zhì)量控制，舍棄低質(zhì)量序列之后序列長(cháng)度大部分分布在400~600 bp之間，平均長(cháng)度均在440 bp以上，各樣本序列數均在500 bp以上. 物種分類(lèi)采用RDP classifier軟件. 按照相似度為97%的標準將操作分類(lèi)單位(operational taxonomic units OTU)進(jìn)行分類(lèi)[16],運行軟件mothur(http：//www.mothur.org/)中的summary.single 命令，計算常用的生物多樣性指數，如豐富度指數(Chao/ACE指數)、 覆蓋率指數(good's coverage)和多樣性指數(Shannon指數).

　　2 結果與討論

　　2.1 活性污泥對SCN-的生物降解

　　硫氰化物是焦化原水中含量最高的無(wú)機污染物之一[4]，而在曝氣池中SCN-的濃度約100mg·L-1. SCN-的組成元素 S、 C和N 是生物生長(cháng)所需的營(yíng)養元素，在好氧條件下微生物可以SCN-作為其碳源、 氮源或硫源進(jìn)行生長(cháng),并形成SO42-、 CO2和NH4+代謝產(chǎn)物[15]. 結果表明(如圖 1)，原始污泥和馴化污泥對SCN-的降解速率隨著(zhù)SCN-初始濃度的升高而增大，馴化污泥的降解能力大于原始污泥，初始SCN-濃度為600 mg·L-1時(shí)，原始污泥的降解速率為14.255 mg·(g·h)-1，而馴化污泥的降解速率為15.978 mg·(g·h)-1，表明污泥馴化有利于SCN-降解菌群的富集和降解能力的提高. 解析不同SCN-濃度下馴化污泥的細菌種群結構有助于揭示污泥的降解機制和降解效率.

　　圖 1 活性污泥中SCN-的的降解速率

　　2.2 活性污泥的細菌群落結構多樣性

　　為了分析降解SCN-的細菌群落結構豐富度，在97%相似水平上計算了常見(jiàn)的多樣性指數. 污泥細菌多樣性指數如表 1所示，覆蓋率指數是樣品的測序深度也表明樣品的覆蓋率，3個(gè)樣品的覆蓋率分別是0.97、 0.98和0.98，表明絕大部分的細菌種群都被檢測出來(lái). 隨SCN-馴化濃度的升高，活性污泥中的細菌多樣指數隨之減少，如100 mg·L-1 SCN-的活性污泥經(jīng)過(guò)300 mg·L-1和600 mg·L-1的SCN-培養馴化后，生物分類(lèi)單元(OTUs)從949分別降為749和702，香農指數也從4.42分別減為3.49和3.28，這表明細菌多樣性及結構在不同濃度SCN-的培養下發(fā)生了改變，高濃度的SCN-對群落結構產(chǎn)生脅迫壓力，使其生物多樣性減少. 圖 2同樣顯示不同SCN-濃度對生物群落結構的影響，圖 2(a)生物群落豐富度稀疏曲線(xiàn)顯示600 mg·L-1 SCN-的OTUs最少，100 mg·L-1 SCN-的OTUs最多，說(shuō)明SCN-濃度越大，細菌多樣性越少. 相似的結果也通過(guò)聚類(lèi)分析圖 2(b)得以闡明，聚類(lèi)熱圖采用樣本間unifrac 距離矩陣繪制，顏色塊代表距離值，顏色越紅表示樣本間距離越近，相似度越高，越藍則距離越遠; 100 mg·L-1和300mg·L-1 SCN-培養過(guò)的生物群落聚類(lèi)在一起，且距離較近，說(shuō)明細菌群落結構經(jīng)演替變化可以適應不同的SCN-濃度環(huán)境，SCN-濃度越高對生物群落的脅迫壓力越大，細菌種群差異越大.

　　表 1 細菌群落多樣性指數

　　圖 2 細菌群落豐富度稀疏曲線(xiàn)和聚類(lèi)分析

　　不同濃度的SCN-對活性污泥生物群落結構產(chǎn)生的影響不同，污泥生物群落維恩圖(圖 3)表明3個(gè)污泥樣品共享部分OTUs占整個(gè)OTUs的13%，這部分微生物群落結構受SCN-濃度的波動(dòng)干擾小，推測其對硫氰化的耐受性高，其中部分細菌菌群可能是SCN-降解菌群，可以SCN-為唯一碳源、 硫源和能源; 另一部分菌群可能與污泥的穩定性有關(guān). 此外，圖 3表明300mg·L-1和600 mg·L-1 SCN-培養的污泥共享的OTUs為106，300 mg·L-1 SCN-和原始污泥共享的OTUs為104，而600 mg·L-1SCN-和原始污泥共享的OTUs為51，同樣說(shuō)明高濃度SCN-馴化污泥與原始污泥的細菌群落多樣性相差較大.

　　圖 3 細菌群落結構維恩圖

　　2.3 細菌群落結構組成和豐度

　　為了解析細菌群落結構組成和豐度，對質(zhì)控后的序列采用RDP classifier軟件進(jìn)行物種分類(lèi)，圖 4、 表 2和圖 5分別為細菌群落結構在門(mén)、 目和屬水平上的組成和豐度. 污泥的優(yōu)勢門(mén)(圖 4)主要有Proteobacteria、 Bacteroidetes、 Chlorobi、 Planctomycetes、 Acidobacteria、 Nitrospira、 Firmicutes、 未分類(lèi)的和微小菌群，與Ma等[16]的研究結果基本一致. Proteobacteria在焦化廢水中占主導地位[11]，其在3個(gè)污泥樣品中的豐度也最高，分別為47.47%、 50.28%和38.65%. Bacteroidetes為第二優(yōu)勢門(mén)，豐度分別為36.78%、 31.57%和46.11%，Acidobacteria在3個(gè)污泥樣品中的豐度分別為2.62%、 7.33%和7.99%. Bacteroidetes 和 Actinobacteria為好氧污泥中的優(yōu)勢門(mén)，Mclellan等[19]發(fā)現二者也為污水處理廠(chǎng)進(jìn)水中的優(yōu)勢細菌. Chlorobi的豐度分別為0.21%、 1.65%和3.19%. Firmicutes在3個(gè)污泥樣品中的豐度分別為4.04%、 0.35%和0.25%，而在厭氧污泥中的豐度高達92.3%[20]. Nitrospira為亞硝化細菌，在3個(gè)活性污泥中的豐度低于1%. 各種分子指紋圖譜的方法已被開(kāi)發(fā)用于評估微生物群落結構，而高通量測序可以檢測更多未知和低豐度的序列[21]. 雖然90%以上的細菌門(mén)類(lèi)在3個(gè)污泥樣品中被鑒定，然而無(wú)法分類(lèi)或者未知的門(mén)類(lèi)在3個(gè)污泥樣品中的豐度分別為6.54%、 7.69%和2.79%.

　　圖 4 細菌群落結構門(mén)水平上的組成

　　表 2 細菌群落結構目水平上的組成

　　圖 5 細菌群落結構屬水平上的分布

　　目水平上分類(lèi)表 2(每種目的豐度至少在一個(gè)樣品中不小于1%)表明： 3個(gè)污泥樣品的優(yōu)勢目均為Burkholderiales、 Sphingobacteriales 和Xanthomonadales. Sphingobacteriales 在3個(gè)污泥樣品中的豐度分別為32.85%、 29.5%和45.08%，Xanthomonadales的豐度分別為3.8%、 18.5%和14.48%，而B(niǎo)urkholderiales的豐度分別為13.3%、 8.95%和11.92%. Burkholderiales可以降解烴類(lèi)物質(zhì)，是芳烴污染的地表水中的優(yōu)勢目[22]，可降解焦化廢水中的苯酚和PAHs(芘)[23, 24]. Rhodospirillales、 Sphingomonadales、 Clostridiales、 Parvularculales、 Rhodobacterales和Myxococcales等是3個(gè)污泥樣品所共享的目，雖然各自的豐度不同，但表明其對不同SCN-濃度脅迫下有一定的適應性，也說(shuō)明群落結構可通過(guò)自身的調整以適應不同的SCN-濃度環(huán)境.

　　細菌群落結構在屬水平上的組成和豐度(每種屬的豐度至少在一個(gè)樣品中不小于1%)表明(圖 5)： 3個(gè)污泥主要的屬為20個(gè)，不同屬在不同污泥樣品中的豐度不同，有些菌的豐度會(huì )隨SCN-濃度的升高而提高，有些菌株的豐度會(huì )隨SCN-濃度的升高而降低，結果類(lèi)似于門(mén)和目分類(lèi)得到的結論，進(jìn)一步說(shuō)明細菌種群對不同SCN-濃度脅迫下有一定的適應性，群落結構可以通過(guò)自身的組成變化適應不同的SCN-濃度環(huán)境. Flavisolibacter、 Ferruginibacter、 Caldimonas、 Steroidobacter、 Thiobacillus和Gp4，為100 mg·L-1 SCN-培養的污泥樣品中主要的屬，Flavisolibacter、 Thermomonas、 Thiobacillus、 Gp4、 Steroidobacter和Comamonas，為300 mg·L-1 SCN-培養的污泥樣品中主要的屬，而600 mg·L-1 SCN-培養的污泥樣品中主要的屬為Flavisolibacter、 Thermomonas、 Gp4、 Thiomonas、 Sphingopyxis和Ignavibacterium. Flavisolibacter可能參與聚羥基脂肪酸酯的合成[25]，而Thermomonas在50℃生長(cháng)的能力有助于細菌細胞壁組分的修飾，如蛋白質(zhì)和(糖)脂質(zhì)的化學(xué)修飾[26]，自養微生物Thiobacillus 和Thiomonas可利用H2S作為能源生長(cháng)[27]. 焦化廢水中分離出Thiobacillus 和Acremonium菌株能以SCN-為唯一碳源和能源生長(cháng)[28, 29]，本研究未發(fā)現Acremonium的存在. Thiobacillus普遍存在于含SCN-的廢水處理系統中，可有效降解SCN- [11]，Thiobacillus為100 mg·L-1和300 mg·L-1 SCN-培養的污泥樣品中的優(yōu)勢菌，豐度分別為3.07%和8.63%，而在600 mg·L-1 SCN-培養的污泥樣品中的豐度僅為0.27%，表明在SCN-濃度<300 mg·L-1時(shí)Thiobacillus可能是SCN-主要的降解菌，然而SCN-濃度>300 mg·L-1時(shí)，可能有其他菌群參與SCN-的降解，如Arthrobacter、 Bacillus、 Escherichia、 Klebsiella、 Methylobacterium、 Ralstonia和Pseudomonas為SCN-降解菌[30]，除Escherichia和Methylobacterium外，這些SCN-降解菌在本實(shí)驗中均已經(jīng)檢測出來(lái)，然而其豐度很低，推測這些低豐度的SCN-降解菌可能在高濃度SCN-下發(fā)揮協(xié)同降解作用. 另外，不同的細菌具有不同的污染物降解功能，同一種細菌也可具有降解多種不同污染物的功能，如Comamonas菌可降解酚類(lèi)、 PAHs和雜環(huán)類(lèi)物質(zhì)(如吲哚、 喹啉)等[16]; Thiobacillus不僅能降解SCN-，還具有很強的反硝化能力[31]; Pseudomonas可降解SCN-、 酚類(lèi)化合物、 苯、 甲苯和PAHs等，同時(shí)具有硝化和反硝化的能力[32~35]. 污泥是一個(gè)復雜的微生物群體，焦化廢水中SCN-的降解可能是多種菌群共同作用的結果，菌群間復雜的相互作用關(guān)系還有待進(jìn)一步研究.

　　3 結論

　　(1) 活性污泥經(jīng)300~600 mg·L-1 SCN-的馴化后，其SCN-的降解能力提高，細菌多樣性隨SCN-濃度升高降低.

　　(2) 活性污泥細菌群落結構組成中的優(yōu)勢門(mén)為Proteobacteria和Bacteroidetes，優(yōu)勢目為Burkholderiales、 Sphingobacteriales 和Xanthomonadales，Flavisolibacter是系統中含量最高的屬，Thiobacillus是<300 mg·L-1 SCN-焦化廢水中主要的SCN-降解菌，在600 mg·L-1SCN-高濃度時(shí)低豐度的SCN-降解菌群可能發(fā)揮協(xié)同降解作用.